2022-11-17
我們的所有細胞在正常生理狀態或受到外界刺激下，都可以分泌一類具有膜結構的囊泡，被稱為細胞外囊泡。
細胞外囊泡是由多種哺乳動物細胞主動釋放的納米級胞外小泡，根據其生物起源、大小、生物物理特性可分為外泌體、微囊泡及凋亡小體。在我們的臨床研究中主要關注的是外泌體。
圖1：外泌體結構示意圖
與其它幾類細胞外囊泡相比，外泌體的結構更加穩定，可以包裹的內容物也更加豐富，使外泌體成為優異的藥物遞送載體，且豐富的內含物使之具有診斷潛力。外泌體可以在相鄰和遠端細胞之間傳遞蛋白質和遺傳信息，遞送多種類型的分子（包括核酸）。此外，外泌體具有穿過細胞膜、不易引起免疫反應特點，這也使其在基因、抗腫瘤等藥物的體內運送方面具有獨特優勢。
外泌體在人體的腦脊液，唾液，血液，乳液等體液中均有分布，此外，腫瘤組織，神經元，干細胞等在體外培養的細胞均會分泌大量的外泌體。外泌體本身具有高度異質性，且其異質性根據其大小、含量(載物)、對受體細胞的功能影響以及細胞來源會出現差異，具備不同的功能，研究證實，外泌體具備調節基因轉錄翻譯、細胞增殖與凋亡、轉移與侵襲、血管生成、免疫應答、細胞分化、代謝調控等功能。此外，隨著外泌體在臨床方面優勢的顯現，其發展正處于高速發展的階段，無論是國內還是國外，對于外泌體的研究都在逐步增多。
外泌體的發展歷程
1983年，Eberhard G.Trams于綿羊網織紅細胞中發現一種有膜結構的小囊泡（外泌體）；
1987年，Johnstone將其命名為"Exosome"（外泌體）；
1996年，GRaposo發現類似于B淋巴細胞能分泌抗原提呈外泌體，這種外泌體攜帶MHC-I類分子、共刺激因子和粘附因子。研究表明這種B細胞來源的外泌體可以直接刺激效應CD4+細胞的抗腫瘤反應。
1998年，LZitvogel等發現樹突細胞(DO cell)也能產生有抗原提呈能力的外泌體，而且外泌體含有功能性的MHC-I類和I類分子，還有共刺激因子。這種外泌體啟動了特異性的CTL殺傷作用，促進了T細胞依賴的抗腫瘤效應。
2007年，HValadi等發現，細胞之間可以通過外泌體中的RNA來交換遺傳物質。這意味著細胞可以通過外泌體影響另外一個細胞，甚至可以把自己的基因強加給另外一個細胞。研究人員逐漸對小小的外泌體產生了極大的好奇。他們發現，腫瘤細胞的外泌體與正常細胞的外泌體之間存在差異，腫瘤的外泌體會促進腫瘤的生長和轉移，腫瘤周圍組織細胞分泌的外泌體具備殺傷腫瘤細胞的能力。
2013年，諾貝爾生理或醫學獎頒給了美國科學家JamesERothman和RandyV V.Schekman，德國科學家ThomasCSüdhof，以表彰他們發現細胞內部囊泡(外泌體等)運輸調控機制。使外泌體的研究達到全新的高度。
2015年，JHuan等人證實了急性髓細胞白血病的外泌體在白血病的骨髓微環境中具有抑制造血干細胞的功能。
2015年，WANGY等人發現誘導多能干細胞的外泌體可以在心肌細胞受到急性心肌缺血影響時，給心肌細胞傳送保護信號。
2015年6月24日，德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的一項研究在《Nature》雜志上發布，研究發現存在于癌癥外泌體(exosomesF的olvpican-1(GPC1)基因編碼蛋白，或許可以作為一種潛在非侵入性診斷和篩查工具的組成部分，用來檢測有可能尚處于適合手術治療階段的早期胰腺癌。研究發現，在胰腺癌小鼠模型還未顯示出MRI可以檢測到的胰腺疾病跡象之時，GPC1+crExos就檢測到了胰腺癌的可能性。相比常用的CA19-9生物標志物，GPC1+crExos似乎是一種更可靠的篩查工具。
2016年1月21日，世界首款由Exosome Diagnostics公司研發生產的癌癥診斷產品 ExoDxLung通過FDA認證。該檢測試劑盒是通過分析血液中的外泌體RNA(exoRNA)可以靈敏、準確、實時檢測非小細胞肺癌患者的EML4-ALK突變。ExoDxLung檢測非小細胞肺癌的靈敏度可達88%，Exosome Diagnostics表示其特異性高達100%，可以用于幫助醫生確定哪些非小細胞肺癌患者可用ALK抑制劑靶向治療，尤其是對那些不能或者不愿進行組織活檢的病人。
就外泌體的研究方向而言，干細胞、免疫、 microRNA、靶向給藥、癌癥的診斷及治療等都是熱門研究領域。目前，已有越來越多的學者開始關注外泌體在腫瘤發生和發展中的作用及其機制。
外泌體發展現狀
1、外泌體研發情況
目前學術界、工業界對于外泌體的研究研發方向主要聚焦在疾病早期診斷的標志物、疾病治療藥物、外泌體的抑制、以及藥物遞送載體四大方面。目前研究較多的主要集中在來源于多能干細胞和腫瘤細胞的外泌體上。
①外泌體在間充質干細胞（MSCs）領域研究進展
世界抗衰老臨床醫學的先驅、美國抗衰老醫學研究會主席Ronald Klatz博士稱：“外泌體是干細胞技術的下一個發展方向”。而干細胞外泌體的進步也是得益于干細胞技術的發展。另外，MSCs來源的外泌體具有與母細胞相似的生物學功能，但與MSCs相比具有以下優勢：(1)外泌體穩定，可長期保存在-80℃環境中，內容物不易降解；(2)外泌體更安全，不存在異倍體的可能性；(3)外泌體可以跨膜轉運，直接靶向作用于病變部位；(4)“無細胞”治療，降低了免疫排斥的風險，致瘤性降低，解決了MSCs在體內存活率低的問題。
例如，心血管疾病是導致人類死亡的主要原因之一，而間充質干細胞釋放的外泌體（MSCs旁分泌的集合體，EVs）作用于心臟和血管，可以發揮抗凋亡、抗炎和抗纖維化、抑制氧化應激、增強血管生成等作用，是MSCs移植治療關鍵的作用機制。外泌體在癌癥、心血管疾病、結核病和中樞神經系統等疾病的診斷、治療均已顯示出良好的效果。
所列局限性尚未有足夠研究正式明確，但考慮到間充質干細胞在研究中所潛在的問題，由其衍生的外泌體應用是否也會在將來的研究中顯示潛在局限性，尚需研究證明。
②外泌體在腫瘤領域中研究進展
有研究發現，MSCs發揮作用主要是由于其旁分泌機制，而外泌體作為旁分泌機制的重要因子在腫瘤發生發展及治療方面受到越來越多的關注。外泌體在腫瘤免疫中起著雙刃劍的作用，在腫瘤微環境中，外泌體能夠在腫瘤細胞、免疫細胞和其他細胞之間傳遞生物活性分子，幫助癌細胞逃避免疫監視誘導免疫耐受，同時，來自免疫細胞的外泌體能夠發揮抑制腫瘤生長、增殖和轉移的作用。
目前，外泌體在癌癥中主要用于腫瘤疫苗和藥物載體。外泌體生物相容性好，更低的免疫原性；幾乎無毒性；納米尺寸和柔韌性使它們能夠跨越主要的生物屏障，例如血腦屏障、胎盤屏障等，實現復雜系統部位的遞藥，是安全而穩定的內源性納米載體。
圖2：MSCs-Exo 潛在局限性
臨床上用于體內遞送的mRNA載體主要是脂質納米顆粒，但由于其封裝過程耗時、復雜，不適合個性化腫瘤疫苗的定制生產。因此，迫切需要一種能夠快速展示mRNA抗原并具有先天免疫刺激功能的新型納米載體，以進一步開發基于mRNA的個性化腫瘤疫苗。國家納米科學中心聶廣軍團隊使用細菌來源的外泌體（OMVs）作為mRNA遞送平臺，并通過基因工程對其進行表面修飾（OMV-LL），試驗結果表明OMV-LL-mRNA不但能夠顯著抑制腫瘤進展，而且可以誘導長期免疫記憶。這種外泌體載體不同于LNP，可用于個性化mRNA腫瘤疫苗開發，有望在mRNA疫苗中得到廣泛應用。
③外泌體作為生物標志物
隨著外泌體研究的深入，許多研究表明，外泌體可作為疾病早期診斷的生物標志物。首先，外泌體廣泛分布于體液中，如血液、尿液、精液、羊水和唾液，因此很容易分離。其次，如上所述，不同衍生的外泌體在組成上有所不同，表達特定的miRNA、mRNA 和蛋白質。這些成分的異常變化可以用來診斷疾病和預測患者的預后。例如，可以在前列腺癌患者的尿外泌體中檢測到 PCA3 mRNA 和 TMPRSS2:ERG 融合轉錄物。此外，大量 miRNA 被認為是新的生物標志物。
圖3：作為生物標志物的潛在外泌體 miRNA
然而，作為生物標志物的外泌體存在一些缺陷。首先，來自癌癥患者和健康人的外泌體在成分上可能沒有可檢測到的差異。在上述研究中，TMPRSS2:ERG 融合轉錄本可以在惡性程度較高的患者中檢測到，但在惡性程度較低的患者中則無法檢測到。26其次，外泌體中的 miRNA 的特異性不足以區分不同類型的癌癥。例如，miR-21 在幾乎所有癌癥中上調，例如黑色素瘤、肝細胞癌、乳腺癌、腦癌、胃癌和結腸癌；32 miR-125b 在急性髓性白血病 (AML) 中上調，但在慢性淋巴細胞白血病 (CLL) 中下調。33 第三，考慮到臨床實踐的準確性、成本和效率，大多數外泌體生物標志物在臨床上并不可行。
2、外泌體市場狀況
近幾年，基礎科研領域有關外泌體的載藥、診斷、預后監測、免疫療法等方向的論文發表數量呈近爆炸式增長，平均每年外泌體相關論文都在3000篇以上，2020年度國家自然科學基金申請項目的評審結果中，外泌體相關課題中標達到兩千余項。
圖4：外泌體領域發表論文數量的增長
同時在產業轉化領域，近年來外泌體領域的初創企業數量和規模不斷增長，全球有近50家企業“同臺競技”。
由于外泌體的標志物并不明確等原因，外泌體診斷領域發展相對緩慢。大多企業選擇布局進展更快的外泌體載藥或者外泌體藥物開發領域，成功的幾率會更大些。
全球外泌體相關企業近1/3布局外泌體診斷業務；超過2/3布局外泌體治療。集中布局在腫瘤、腦部疾病、疫苗開發、基因治療/罕見病四大領域。
圖5：全球外泌體相關企業在各細分領域布局業務情況
自全球爆發的COVID-19使對外泌體的研究出現高潮，外泌體可以有效地用于冠狀病毒疫苗的開發。根據全球市場研究公司Data Bridge Market Research的數據，2018年全球外泌體市場達到65億美元。該市場預計將以21.9%的復合增長率增長，到2026年將增長到310億美元，市場空間極具發展潛力。
外泌體領域的產業轉化研究，國外已經發展很多年，目前已有一些突破性的成果和技術相對成熟的公司。但國內利用外泌體的治療市場處于起步階段，國內外在外泌體的產業化研究方面至少相差5年時間。著力于解決制約外泌體產業發展的關鍵問題，如外泌體的靶向性遞送，分離純化，載藥效率、制劑等問題，完成這些基礎性問題的突破才可能實現產業上的突破，在全球外泌體市場中占得更多份額。
外泌體未來發展
外泌體運用于藥物載體的主要挑戰在于如何獲得高產量的純外泌體、如何增強外泌體裝載各種貨物的能力和靶向能力但不破壞外泌體結構。診斷治療中外泌體要求更精細，主要難點在于：⑴外泌體標志物不明確、未經臨床驗證；⑵外泌體分離純度要求較高，需要保證相關生物標志物直接來源于外泌體而非其它分泌物或者細胞器；⑶檢測同種疾病，外泌體診斷產品是否更加靈敏和準確，成本上是否更具優勢，也是決定外泌體診斷產品是否被患者所選擇的重要條件。種種困難的存在，造成目前外泌體診斷領域發展地相對緩慢。
圖6：外泌體分離方法優缺點對比
為了獲得高產量的純外泌體，有以下幾種策略：①拓展外泌體來源。②努力將細胞和納米載體的特性結合起來。③增強裝載各種貨物的能力和靶向能力。因此，許多研究人員致力于開發合適的方法來修飾外泌體以裝載藥物或基因。
而從企業的發展策略上來講，由于外泌體診斷產品開發的更多限制和困難，大部分企業選擇布局進展更快的外泌體載藥或者外泌體藥物開發領域，成功的幾率更大。
相對較少的企業布局外泌體診斷領域，并不是放棄外泌體在診斷領域的應用開發。可能是出于風險效益的角度考慮，企業更愿意將外泌體診斷相關的布局放在企業戰略布局的第二梯隊。在搭建外泌體載藥平臺或開發外泌體相關藥物的同時，對外泌體進行更加深入的認識和解，新藥研發者們同樣擁有機會去對外泌體的相關生物標志物進行挖掘和發現。在此過程中，一旦發現任何有價值的生物標志物，再快速跟進布局它在檢測診斷相關疾病方面的應用，更具有指導意義和發展價值。
某種意義上而言，外泌體的藥物載體開發和診斷領域的開發是一個相輔相成的過程。針對外泌體的來源、合成與分泌、攝取等機制研究，針對微環境從外泌體角度解釋疾病發生發展機制的研究，尋找疾病診斷和預后生物標志物，將外泌體作為藥物載體類的研究。不管是研究哪一個方向，都有很多科學問題待解決，系統深入的研究對外泌體整個行業的發展都具有推進作用，各方向布局也會由此展開，所以我們有理由相信外泌體只是“年輕”，它的未來值得大家期待。
參考文獻：
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